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細(xì)胞毒試驗(yàn)的幾種方法
點(diǎn)擊次數(shù)：5823 日期：2014/1/11 14:05:31
細(xì)胞毒試驗(yàn)實(shí)在組織培養(yǎng)中研究淋巴細(xì)胞、抗體或抗體依賴性淋巴細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的一種技術(shù),也是在體外研究特異性細(xì)胞免疫比較可靠和靈敏的方法,目前微量細(xì)胞毒試驗(yàn)是應(yīng)用*廣的一種方法.
（一）淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒試驗(yàn)方法：
1) 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物制成懸液,并稀釋至需要的細(xì)胞濃度.
2) 于微量試驗(yàn)班的小孔內(nèi)分別接種0.2ml腫瘤細(xì)胞（內(nèi)含5×102）個(gè)細(xì)胞,37℃培育24h.
3) 細(xì)胞貼壁后,輕輕輕去培養(yǎng)基,加1mlPBS洗滌,輕去洗滌液及未貼壁細(xì)胞.
4) 向小孔分別加入0.2ml不同濃度的淋巴細(xì)胞（分別含有5×105個(gè)細(xì)胞,5×104個(gè)細(xì)胞,5×103個(gè)細(xì)胞）,使淋巴細(xì)胞與癌細(xì)胞之比依次為1000：1、100：1、10：1.
5) 45min后加0.1ml5%胎牛血清,37℃繼續(xù)培養(yǎng)2-3天.
6) 2%臺(tái)盼藍(lán)染色,翻轉(zhuǎn)微量試驗(yàn)班,計(jì)數(shù)活存的腫瘤細(xì)胞,并設(shè)正常人淋巴細(xì)胞代替腫瘤患者淋巴細(xì)胞作對(duì)照,每份需同時(shí)做3個(gè)復(fù)孔,分別檢查各孔中存活活細(xì)胞數(shù),按下列公式計(jì)算細(xì)胞毒率,并做t檢驗(yàn).
（二） 抗體加補(bǔ)體的細(xì)胞毒試驗(yàn)方法：
此法是組織相容性抗原（HLA）檢查技術(shù)中*常用的一種方法.也稱微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn).人體的組織相容性抗原存在于淋巴細(xì)胞膜的表面,從供者與受者的血液分離淋巴細(xì)胞作為靶細(xì)胞,以各種定型單價(jià)抗血清與家兔血清補(bǔ)體作為效應(yīng)系統(tǒng).如果淋巴細(xì)胞表面具有與抗血清相對(duì)應(yīng)的抗原,則淋巴細(xì)胞就會(huì)受損傷或致死而被臺(tái)盼藍(lán)染色.
1、 材料：
a.淋巴細(xì)胞
b. 血清.小牛血清（56℃滅活30min）
c.待測(cè)血清.收集多產(chǎn)婦分娩時(shí)的胎盤剝離后的血,分出血清,疊氮納防腐,4℃保存.
d.已知陽性對(duì)照血清.用上海市中心血站制備的馬抗人淋巴細(xì)胞血清（ALS）,同時(shí)做1：3稀釋.
e.補(bǔ)體.新鮮家兔混合血清,分裝小試管,保存于-20℃.
2、 操作步驟：
a.在塑料試驗(yàn)盒內(nèi)加入醫(yī)用液體石蠟油20ml,放進(jìn)一塊52孔微量玻璃試驗(yàn)班,使板沉至盒底.
b.用0.25ml的微量定量加液器分別加入待測(cè)血清和陽性對(duì)照血清2-2ul/孔,陰性對(duì)照用Hanks液代之.加樣針尖應(yīng)磨平.
c.用同法每孔內(nèi)加入待測(cè)的淋巴細(xì)胞2-3ul,應(yīng)先加陰性對(duì)照和補(bǔ)體對(duì)照孔,然后加待測(cè)孔,*后加陽性血清對(duì)照孔,加后輕搖使其混勻,置室溫作用1h.
d.每孔加入兔補(bǔ)體5-7ul（按加淋巴細(xì)胞順序加入）,置37℃培育45min（或室溫作用1h）.
e.每孔加入2%臺(tái)盼藍(lán)等滲液3-5ul室溫中靜置20min,吸去藍(lán)色上清.
f.普通顯微鏡檢查,記錄每孔中死細(xì)胞（著色細(xì)胞）數(shù).
死細(xì)胞.體積稍大,著藍(lán)色,無折光性.
活細(xì)胞.大小正常,未著色,較透亮.
判斷標(biāo)準(zhǔn)（每次實(shí)驗(yàn),需做3-6個(gè)復(fù)本）.
其中著色細(xì)胞：《=20%為陰性, 20%--50%為弱陽性, 50%--70%為陽性, 》=70%為強(qiáng)陽性.
（三）ADCC試驗(yàn)：
抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒作用用來檢查K細(xì)胞的Fc受體,該細(xì)胞結(jié)合抗體殺傷靶細(xì)胞的作用是非特異性的,故稱為抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC).
（四） NK細(xì)胞毒試驗(yàn)之51Cr稀放法：
1) 效應(yīng)細(xì)胞的制備
用常規(guī)的Fico11分離法分離外周血中的耽擱核細(xì)胞,經(jīng)玻璃瓶37℃貼壁2h,以除去單核-巨噬細(xì)胞,計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù),使細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml,細(xì)胞存活率為95%以上（小鼠可用鼠脾細(xì)胞）.
2) 靶細(xì)胞制備
取培養(yǎng)24-48h的K562細(xì)胞,培養(yǎng)基洗一次,用營(yíng)養(yǎng)液配成4×106個(gè)/0.5ml,加3.7MBq 51Cr,37℃水浴90min隔15min搖勻一次,然后洗滌3次,除去游離的51Cr,計(jì)數(shù)活細(xì)胞,稀釋細(xì)胞數(shù)達(dá)1×105個(gè)/ml.
3) NK細(xì)胞活性測(cè)定
用4h短程稀放法,自然殺傷組效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞（50：1）各0.2ml,自然稀放組以營(yíng)養(yǎng)液代替效應(yīng)細(xì)胞,*大稀放組以2%SDS代替效應(yīng)細(xì)胞,分別置37℃接觸4h,然后各管加冷Hanks液0.6ml終止反應(yīng),離心（1000r/min）10min,吸上清0.5ml,用γ計(jì)數(shù)器測(cè)放射性.
（五）NK細(xì)胞毒試驗(yàn)之3H-TdR法：
取培養(yǎng)24-48h的K562靶細(xì)胞,稀釋至5 × 104個(gè)/ml,效應(yīng)細(xì)胞為人外周血單個(gè)核細(xì)胞,制成5 × 106個(gè)/ml細(xì)胞懸液,加入微板中,每孔加入靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞各0.1ml,靶細(xì)胞自然摻入對(duì)照組僅加入靶細(xì)胞懸液0.1ml,用RPMI 1640培養(yǎng)基0.1ml代替效應(yīng)細(xì)胞,每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔,加入細(xì)胞懸液后,每孔立即加入3H-TdR37kBq,然后置于37℃、5%CO2中培養(yǎng)20h,收集細(xì)胞于纖維濾紙上,用γ計(jì)數(shù)器測(cè)定cpm,用特異抑制百分率（Pi）表示NK細(xì)胞活化.
（六）NKCF檢測(cè)（MTT法）：
培養(yǎng)3天的K562細(xì)胞經(jīng)完全培養(yǎng)基洗滌1次后配成2.5×105個(gè)/ml細(xì)胞懸液,在微孔培養(yǎng)板上加入50ul/孔,再加入含NKCF標(biāo)本50ul/孔,標(biāo)本不同稀釋度為1：2、1：4、1：8、1：16、、、、、、,陰性對(duì)照為無NKCF的培養(yǎng)基,陽性對(duì)照為蒸餾水,每份標(biāo)本設(shè)3個(gè)復(fù)孔取其平均值,另設(shè)1個(gè)無細(xì)胞空白對(duì)照.置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,加MTT厚的過程與活細(xì)胞檢測(cè)基本相同.按公式計(jì)算各稀釋度的NKCF值.
此外還有臺(tái)盼藍(lán)排除法,通過計(jì)算細(xì)胞死亡率（或存活率）來表示NK細(xì)胞的殺傷活性,方法簡(jiǎn)便易行,但有客觀因素影響,對(duì)NK細(xì)胞的殺傷效應(yīng)也可采用MTT法.
（七）LAK細(xì)胞毒試驗(yàn)之125I釋放法：
（1）LAK細(xì)胞的制備 經(jīng)乙醚麻醉后,無菌取鼠脾臟,淋巴細(xì)胞經(jīng)擠壓后,用4層紗布過濾,經(jīng)3次離心洗滌,制成細(xì)胞懸液,將濃度調(diào)至107個(gè)/ml,加IL-2制品1ml,置于37℃、5%CO2孵育5天,存活的淋巴細(xì)胞可作為L(zhǎng)AK細(xì)胞使用.
（2）LAK細(xì)胞體外毒活性測(cè)定 用125I脫氧尿嘧啶核苷標(biāo)記WBT-2M纖維肉瘤靶細(xì)胞,每106個(gè)細(xì)胞加125I尿嘧啶核苷148kBq,37℃靜置培養(yǎng)14h,接著用Hanks液離心3次,充分洗滌,然后分別與效應(yīng)細(xì)胞置微量培養(yǎng)板中共同孵育6h,吸取上清,用γ計(jì)算器測(cè)定同位素的釋放量,按公式計(jì)算其細(xì)胞毒的百分率.
（八）CTL的細(xì)胞毒試驗(yàn)：
取淋巴細(xì)胞1 × 106個(gè)/ml,經(jīng)ConA 3ug/ml刺激培養(yǎng)5天獲效應(yīng)CTL,靶細(xì)胞為用125I-UdR標(biāo)記的肥大細(xì)胞瘤P815細(xì)胞或者為K562細(xì)胞,其方法為每孔加入50ulCTL,70ul含1 × 104個(gè)125I-UdR標(biāo)記的P815細(xì)胞及30ul 1/25稀釋的PHA,微孔經(jīng)1200r/min離心5min后,37℃培養(yǎng)3.5h后取出,再加入0.5%胰蛋白酶50ul再培養(yǎng)30min后以1200r/min離心,取每孔中上清100ul加入小玻璃管中,將每孔中的細(xì)胞收獲于玻璃纖維質(zhì)上,用γ計(jì)算器分別測(cè)上清及細(xì)胞中cpm值,按公式計(jì)算殺傷效應(yīng).
（一）淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒試驗(yàn)方法：
1) 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物制成懸液,并稀釋至需要的細(xì)胞濃度.
2) 于微量試驗(yàn)班的小孔內(nèi)分別接種0.2ml腫瘤細(xì)胞（內(nèi)含5×102）個(gè)細(xì)胞,37℃培育24h.
3) 細(xì)胞貼壁后,輕輕輕去培養(yǎng)基,加1mlPBS洗滌,輕去洗滌液及未貼壁細(xì)胞.
4) 向小孔分別加入0.2ml不同濃度的淋巴細(xì)胞（分別含有5×105個(gè)細(xì)胞,5×104個(gè)細(xì)胞,5×103個(gè)細(xì)胞）,使淋巴細(xì)胞與癌細(xì)胞之比依次為1000：1、100：1、10：1.
5) 45min后加0.1ml5%胎牛血清,37℃繼續(xù)培養(yǎng)2-3天.
6) 2%臺(tái)盼藍(lán)染色,翻轉(zhuǎn)微量試驗(yàn)班,計(jì)數(shù)活存的腫瘤細(xì)胞,并設(shè)正常人淋巴細(xì)胞代替腫瘤患者淋巴細(xì)胞作對(duì)照,每份需同時(shí)做3個(gè)復(fù)孔,分別檢查各孔中存活活細(xì)胞數(shù),按下列公式計(jì)算細(xì)胞毒率,并做t檢驗(yàn).
（二） 抗體加補(bǔ)體的細(xì)胞毒試驗(yàn)方法：
此法是組織相容性抗原（HLA）檢查技術(shù)中*常用的一種方法.也稱微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn).人體的組織相容性抗原存在于淋巴細(xì)胞膜的表面,從供者與受者的血液分離淋巴細(xì)胞作為靶細(xì)胞,以各種定型單價(jià)抗血清與家兔血清補(bǔ)體作為效應(yīng)系統(tǒng).如果淋巴細(xì)胞表面具有與抗血清相對(duì)應(yīng)的抗原,則淋巴細(xì)胞就會(huì)受損傷或致死而被臺(tái)盼藍(lán)染色.
1、 材料：
a.淋巴細(xì)胞
b. 血清.小牛血清（56℃滅活30min）
c.待測(cè)血清.收集多產(chǎn)婦分娩時(shí)的胎盤剝離后的血,分出血清,疊氮納防腐,4℃保存.
d.已知陽性對(duì)照血清.用上海市中心血站制備的馬抗人淋巴細(xì)胞血清（ALS）,同時(shí)做1：3稀釋.
e.補(bǔ)體.新鮮家兔混合血清,分裝小試管,保存于-20℃.
2、 操作步驟：
a.在塑料試驗(yàn)盒內(nèi)加入醫(yī)用液體石蠟油20ml,放進(jìn)一塊52孔微量玻璃試驗(yàn)班,使板沉至盒底.
b.用0.25ml的微量定量加液器分別加入待測(cè)血清和陽性對(duì)照血清2-2ul/孔,陰性對(duì)照用Hanks液代之.加樣針尖應(yīng)磨平.
c.用同法每孔內(nèi)加入待測(cè)的淋巴細(xì)胞2-3ul,應(yīng)先加陰性對(duì)照和補(bǔ)體對(duì)照孔,然后加待測(cè)孔,*后加陽性血清對(duì)照孔,加后輕搖使其混勻,置室溫作用1h.
d.每孔加入兔補(bǔ)體5-7ul（按加淋巴細(xì)胞順序加入）,置37℃培育45min（或室溫作用1h）.
e.每孔加入2%臺(tái)盼藍(lán)等滲液3-5ul室溫中靜置20min,吸去藍(lán)色上清.
f.普通顯微鏡檢查,記錄每孔中死細(xì)胞（著色細(xì)胞）數(shù).
死細(xì)胞.體積稍大,著藍(lán)色,無折光性.
活細(xì)胞.大小正常,未著色,較透亮.
判斷標(biāo)準(zhǔn)（每次實(shí)驗(yàn),需做3-6個(gè)復(fù)本）.
其中著色細(xì)胞：《=20%為陰性, 20%--50%為弱陽性, 50%--70%為陽性, 》=70%為強(qiáng)陽性.
（三）ADCC試驗(yàn)：
抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒作用用來檢查K細(xì)胞的Fc受體,該細(xì)胞結(jié)合抗體殺傷靶細(xì)胞的作用是非特異性的,故稱為抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC).
（四） NK細(xì)胞毒試驗(yàn)之51Cr稀放法：
1) 效應(yīng)細(xì)胞的制備
用常規(guī)的Fico11分離法分離外周血中的耽擱核細(xì)胞,經(jīng)玻璃瓶37℃貼壁2h,以除去單核-巨噬細(xì)胞,計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù),使細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml,細(xì)胞存活率為95%以上（小鼠可用鼠脾細(xì)胞）.
2) 靶細(xì)胞制備
取培養(yǎng)24-48h的K562細(xì)胞,培養(yǎng)基洗一次,用營(yíng)養(yǎng)液配成4×106個(gè)/0.5ml,加3.7MBq 51Cr,37℃水浴90min隔15min搖勻一次,然后洗滌3次,除去游離的51Cr,計(jì)數(shù)活細(xì)胞,稀釋細(xì)胞數(shù)達(dá)1×105個(gè)/ml.
3) NK細(xì)胞活性測(cè)定
用4h短程稀放法,自然殺傷組效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞（50：1）各0.2ml,自然稀放組以營(yíng)養(yǎng)液代替效應(yīng)細(xì)胞,*大稀放組以2%SDS代替效應(yīng)細(xì)胞,分別置37℃接觸4h,然后各管加冷Hanks液0.6ml終止反應(yīng),離心（1000r/min）10min,吸上清0.5ml,用γ計(jì)數(shù)器測(cè)放射性.
（五）NK細(xì)胞毒試驗(yàn)之3H-TdR法：
取培養(yǎng)24-48h的K562靶細(xì)胞,稀釋至5 × 104個(gè)/ml,效應(yīng)細(xì)胞為人外周血單個(gè)核細(xì)胞,制成5 × 106個(gè)/ml細(xì)胞懸液,加入微板中,每孔加入靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞各0.1ml,靶細(xì)胞自然摻入對(duì)照組僅加入靶細(xì)胞懸液0.1ml,用RPMI 1640培養(yǎng)基0.1ml代替效應(yīng)細(xì)胞,每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔,加入細(xì)胞懸液后,每孔立即加入3H-TdR37kBq,然后置于37℃、5%CO2中培養(yǎng)20h,收集細(xì)胞于纖維濾紙上,用γ計(jì)數(shù)器測(cè)定cpm,用特異抑制百分率（Pi）表示NK細(xì)胞活化.
（六）NKCF檢測(cè)（MTT法）：
培養(yǎng)3天的K562細(xì)胞經(jīng)完全培養(yǎng)基洗滌1次后配成2.5×105個(gè)/ml細(xì)胞懸液,在微孔培養(yǎng)板上加入50ul/孔,再加入含NKCF標(biāo)本50ul/孔,標(biāo)本不同稀釋度為1：2、1：4、1：8、1：16、、、、、、,陰性對(duì)照為無NKCF的培養(yǎng)基,陽性對(duì)照為蒸餾水,每份標(biāo)本設(shè)3個(gè)復(fù)孔取其平均值,另設(shè)1個(gè)無細(xì)胞空白對(duì)照.置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,加MTT厚的過程與活細(xì)胞檢測(cè)基本相同.按公式計(jì)算各稀釋度的NKCF值.
此外還有臺(tái)盼藍(lán)排除法,通過計(jì)算細(xì)胞死亡率（或存活率）來表示NK細(xì)胞的殺傷活性,方法簡(jiǎn)便易行,但有客觀因素影響,對(duì)NK細(xì)胞的殺傷效應(yīng)也可采用MTT法.
（七）LAK細(xì)胞毒試驗(yàn)之125I釋放法：
（1）LAK細(xì)胞的制備 經(jīng)乙醚麻醉后,無菌取鼠脾臟,淋巴細(xì)胞經(jīng)擠壓后,用4層紗布過濾,經(jīng)3次離心洗滌,制成細(xì)胞懸液,將濃度調(diào)至107個(gè)/ml,加IL-2制品1ml,置于37℃、5%CO2孵育5天,存活的淋巴細(xì)胞可作為L(zhǎng)AK細(xì)胞使用.
（2）LAK細(xì)胞體外毒活性測(cè)定 用125I脫氧尿嘧啶核苷標(biāo)記WBT-2M纖維肉瘤靶細(xì)胞,每106個(gè)細(xì)胞加125I尿嘧啶核苷148kBq,37℃靜置培養(yǎng)14h,接著用Hanks液離心3次,充分洗滌,然后分別與效應(yīng)細(xì)胞置微量培養(yǎng)板中共同孵育6h,吸取上清,用γ計(jì)算器測(cè)定同位素的釋放量,按公式計(jì)算其細(xì)胞毒的百分率.
（八）CTL的細(xì)胞毒試驗(yàn)：
取淋巴細(xì)胞1 × 106個(gè)/ml,經(jīng)ConA 3ug/ml刺激培養(yǎng)5天獲效應(yīng)CTL,靶細(xì)胞為用125I-UdR標(biāo)記的肥大細(xì)胞瘤P815細(xì)胞或者為K562細(xì)胞,其方法為每孔加入50ulCTL,70ul含1 × 104個(gè)125I-UdR標(biāo)記的P815細(xì)胞及30ul 1/25稀釋的PHA,微孔經(jīng)1200r/min離心5min后,37℃培養(yǎng)3.5h后取出,再加入0.5%胰蛋白酶50ul再培養(yǎng)30min后以1200r/min離心,取每孔中上清100ul加入小玻璃管中,將每孔中的細(xì)胞收獲于玻璃纖維質(zhì)上,用γ計(jì)算器分別測(cè)上清及細(xì)胞中cpm值,按公式計(jì)算殺傷效應(yīng).
