人類外周血染色體制備

點(diǎn)擊次數(shù)：3064 日期：2014/2/12 8:53:19

人類外周血染色體制備-主要試劑
1. RPMI-1640按要求10.4克/1000ml配制成溶液，并加入NaHCO3 2.0克/1000ml以緩沖pH。完全溶解后經(jīng)0.22 μm滅菌濾膜抽濾除菌。
2. 肝素鈉（肝素）：稱取0.2g溶于100ml雙蒸水中，濃度為0.2%，15磅20分鐘滅菌。
3. 秋水仙堿（秋水仙素〕，生理鹽水配制成10μg/ml濃度，15磅20分鐘滅菌，分裝，置－20℃。
4. 低滲液：0.35％KCl。
5. 固定液（Carnoy固定液）甲醇∶冰乙酸（3∶l），臨時配制。
6. Giemsa工作液：1份原液和10份磷酸緩沖液，臨時配制。
7. 磷酸緩沖液：1/15M Na2HPO4、1/15M KH2PO4等體積混和。
8. 5% NaHCO3滅菌濾器抽濾備用。
人類外周血染色體制備-主要設(shè)備
5ml注射器（7號針尖），培養(yǎng)瓶、刻度吸管，需15磅滅菌20分鐘。離心管、吸管、量筒、載玻片，經(jīng)洗液按常規(guī)清洗、烘干備用。
超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，天平，離心機(jī)、顯微鏡等。
人類外周血染色體制備-實(shí)驗步驟
1. 細(xì)胞培養(yǎng)
1) 培養(yǎng)基的配制：
在超凈工作臺中，100ml培養(yǎng)基含以下成分和比例：
RPMI-1640 84ml
小牛血清 15ml
PHA 3支
肝素鈉 1ml
卡那霉素終濃度為100單位/ml
以5% NaHCO3（無菌）或1N HCl調(diào)pH至7.2－7.4。
用刻度吸管將培養(yǎng)液分裝入培養(yǎng)瓶（10ml/瓶），4℃?zhèn)溆谩?br />2) 采血：酒精消毒皮膚，肘靜脈采血0.3—0.5ml，立刻將注射針直接穿過培養(yǎng)瓶的橡膠塞，向10ml培養(yǎng)基中注入30—40滴全血，輕搖勻后置37℃恒溫箱培養(yǎng)。
3) 培養(yǎng)：時間為68小時。培養(yǎng)期間，定期輕搖勻，使細(xì)胞充分接觸培養(yǎng)基。
4) 秋水仙素處理：終止培養(yǎng)前2—4小時，在培養(yǎng)液中加入秋水仙堿（用1ml注射器5號針尖滴加2滴，使終濃度為0.07μg/ml）。
2. 染色體制備
1) 收集細(xì)胞：將培養(yǎng)物全部轉(zhuǎn)入潔凈離心管中，以1000rpm離心8—10分鐘，棄上清液。
2) 低滲處理：向刻度離心管中加入預(yù)溫37℃的低滲液8ml，用滴管混勻，置37℃恒溫水浴中低滲15—25分鐘。
3) 預(yù)固定：低滲后加入0.5ml固定液，輕輕混勻后1000rpm離心8—10分鐘。
4) 一固定：棄上清液，加入5ml固定液，輕輕混勻，靜置20分鐘。1000rpm離心，棄上清液。
5) 二固定、三固定：同一固定。
6) 制懸液：棄上清液后，視細(xì)胞數(shù)量多少加入適量固定液制成細(xì)胞懸液。
7) 滴片：吸取細(xì)胞懸液自10—20cm高滴在一張干燥潔凈的載玻片上，輕吹散，氣干。
8) 染色：1:10 Giemsa染色5—10分鐘，細(xì)水洗去多余染液，氣干。
9) 鏡檢：低倍鏡下尋找分散良好、染色適中的分裂相，油鏡下觀察染色體形態(tài)并計數(shù)。
人外周血小淋巴細(xì)胞，通常都處在G1期（或G0期），一般情況下不進(jìn)行分裂。如在培養(yǎng)液中加入植物血凝素（PHA），這種小淋巴細(xì)胞受到刺激可轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，進(jìn)入有絲分裂。短期培養(yǎng)后，經(jīng)秋水仙素處理，低滲和固定，即可得到大量的有絲分裂細(xì)胞。人體的1ml外周血內(nèi)一般含有約1×106～3×106個小淋巴細(xì)胞，足夠染色體標(biāo)本制備和分析之用。